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    10个方面保证16S微生物组研究中最佳一致性

    时间:2021-03-30 11:37:17 来源:myyuju个人图书馆 本文已影响 myyuju个人图书馆手机站

     蒇薂

     羂螄

     蚁羃

     葿膄

     膇螇

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     膂肅

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     精品文档

     10个方面保证

     16S微生物组研究中的最佳一致性

     失之毫厘,谬以千里。这句话用在百变的微生物组研究中最正确不过了。下面结合取样、样品存储、

     DNA提取、文

     库准备、测序和分析等

     10个关键因素说说,如何系统和周

     到的在现有技术下保证

     16S微生物组研究中的最佳一致性?

     全文约3800字,建议阅读时间

     7分钟。

     样本采集1、采样点:不一致的采样点可能会引起微生物群落变化,比如:胃肠道、呼吸道的不同部位,不同的土壤深度等。2、采集方法:不同样本采集方法、非侵入性/较少侵入性的方法能否替代侵入性采集方法说法不一。例如,研究显示,人肠道拭子和活检标本、呼出气冷凝液和肺刷、经口留置胃管和瘘管采样菌群差异显著;牛瘤胃的一项研究则显示,不同的采样方法差别不大;另外,鼻拭子和活检样本、直肠拭子和粪便样本菌群组成又差异不大了。缺乏共识和标准化的情况下,采集方法的一致性和预实验就十分重要了。

     3、均匀度:重要的事说三遍,混匀!混匀!混匀!尤其在

     肠道、土壤等高复杂或大尺度采样时。

     Note:参考已有/文献中数据时,

     首先看采样方法是否一致,

     尽量避免来自不同采样方法的数据的比较。同一项目的待比

     数据尽量保证采集条件、标准和方法的一致性。

     样品存储新鲜样本、直接提取时最好的选择,如果不能,

     最权威的做法无疑是快速冷冻到

     -80

     

     度。新鲜

     VS

     

     冷冻样本:

     两项研究表明,冷冻样本中

     F/B

     明显升高。

     Fouhyetal

     的研

     究显示,冷冻的影响只到属,

     门、纲水平群落无甚差异。

     DNA

     提取前把粪便样本冷藏个

     24h

     或

     72h,微生物组成和多样性

     都不会造成太大差异。

     Lauber等在不同温度下储存土壤、粪便和皮肤样本,发现储存时间对菌群结构和多样性没有显著影响。-

     80oC存储2

     年,群落变化很小,仅OTU数目减少,lactobacilliandbacilli丰度略有增加。

     Note:最好新鲜样本即时处理,如若不行,可以按不同保存

     时间等设置不同批次,处理方法、存储时间和

     DNA提取批

     次的记录很重要。

     03使用保护剂McKain等人探讨了使用低温保护剂(即甘油/磷酸盐缓冲液)来存储瘤胃样品的效果,qPCR发现,没有使用冷冻保护剂的冷冻样品存在拟杆菌的显著损失。

     Choo等人比较了使用几种常用保护剂

     (即RNAlater,

     OMNIgene.GUT

     和Tris-EDTA)和-80oC直接干燥冻存的粪便

     样品的菌群分布,发现OMNIgene.GUT

     效果最好、差异最小;

     Tris-EDTA处理组发现一些重要的细菌类型如

     Escherichia-Shigella,Citrobacter

     和Enterobacter发生了显著

     改变;效果最差的是

     RNAlater,菌群结构发生剧烈变化。

     Note:选用保护剂保存样本时,十分重要的是,所有样本的处理一致(选用同一种保护剂)

     。

     04DNA提取可能影响提取和下游

     PCR实验的原因包括:

     1、

     某些难于裂解的微生物细胞,包括细菌内生孢子和革兰氏阳

     性菌等,影响提取效率。

     2、抑制剂(来自环境、土壤、粪便中的残骸、有机物等)

     可影响下游

     PCR效率,常见的抑制剂主要是有机质

     (如腐植

     酸、胆汁酸盐和多糖等)和一些无机质(如钙离子)

     。

     提取方法上,手提最经典的方法就是酚

     -氯仿提取法。此外,

     适用于各种样本类型的商用试剂盒也非常丰富,这里不多介

     绍。值得注意的是,很多文献都显示,不同的提取方法可能

     引发微生物群落的剧烈变化。

     Note:所有样本的提取尽量采用一致的方法,在保证特定物

     种成功提取的情况下尽可能的提高产量和质量。得率的优化

     可以从核心步骤

     beadbeating开始,建议预先优化整体

     protocol。

     文库构建1、区域和引物选择:基于主流测序平台,目前

     常见的16SrRNA测序区域选择以

     V4(适用于2X250测序)

     和V34(适用于2X300测序)等为主,然而事实上,没有哪种引物是真正通用的,多项不同区域的比较研究给出了各种

     各样的结论。值得注意的是,针对特定关注的微生物类型,也可以选择一些特定的区域扩增。不同引物可能导致相对丰

     度和物种丰富度的改变,进而改变微生物群落结构。

     2、PCR循环数:降低

     PCR循环数可以减少嵌合体的产生。

     3、高保真聚合酶:不同的聚合酶对特定细菌群和整体细菌

     群落结构有显著影响。

     4、起始DNA量:PCR反应的起始

     DNA总量也可能影响细

     菌群落结构。

     Note:16S测序中并没有真正的“金标准”,重要的是选择尽量适合的引物,考虑到PCR试剂和PCR条件的优化,并在

     研究中保持一致。

     06测序平台454:事实上在很长一段时间里,

     Roche454是

     文献和微生物组计划们

     (如HMP)最常见的选择平台,

     虽然

     有同聚物的错误,但是速度读长

     OK,一度独领风骚。然而

     通量小、成本高,逐渐退出竞争链。

     illumina:目前最主流的选择,其中又以

     MiSeq平台更为适用。16Smetabarcoding的特点决定了其对读长的要求,是以目前市场上主要服务的机

     型并不是大热的

     HiSeqX或NovaSeq,而是相对面世更早、

     读长更长的

     MiSeq(2X300)和HiSeq2500(2X250)。

     Pacbio:Pacbio和下面的Nanopore为微生物组研究带来的希

     望是,无需头疼选择好的扩增区域了,超长读长使常规

     16SV1-V9区可以全测通,其他功能微生物的可扩增和鉴定

     范围也进一步拓展。

     Pacbio目前的配套建库、生信分析工具

     日趋成熟,陆续有文章证实技术的可靠性。然成本过高,在

     某些程度上限制了应用范围,目前已在逐渐降低成本。

     Nanopore:号称使长至天际的测序仪,读长优势也很明朗。

     但是错误率偏高,新技术文章积累不足,实验、测序到信息

     分析的普及程度仍需发展。

     计划开展

     16S

     

     测序(注意只是

     测序)时,需要考虑

     4个关键因素:

     1、数据质量

     2、测序成本

     3、测序读长

     

     4、每个

     

     run

     

     可以测

     序的样本数量

     Note:应根据实验目标、

     错误率、测序覆盖率和样本数量的关

     系等选择合适的测序平台。例如,主要研究群落中的核心物

     种,那么就可以通过增加样本数量来降低一个

     run中每个样

     本的覆盖率进而降低成本,如果稀有物种则反之。

     模拟细菌群落1、MockCommunities:已知比例的预混合细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美国标准菌库(ATCC)或ZymoResearch获得。2、Spike-in

     standards:在每个样本中添加标准物,以在单样本基础上进

     行质量控制。为防止与样本序列存在交叉,此处要选择不太

     可能出现在感兴趣样本中的细菌,或者

     insilico设计的和数

     据库中有差异的序列。

     Note:推荐!

     分析策略流程和分解步骤的分析软件和数据库,在之前的文章中做过详细解释和点评

     ,?9个模块+40余款软件+

     老司机辣评

     |16S信息分析流程软件和数据库合集。这里补

     充一项,基因拷贝数校正:

     不同的细菌类型

     16SrRNA基因拷贝数有所不同,想要准确

     获知真实的拷贝数信息比较难。

     但是,目前已经有一些工具,

     可以利用序列数据库和系统遗传信息来校正拷贝数变化。其

     中包括Copyrighter、rrNDB、picanteR包和pplace中的函数,

     以及功能预测工具

     PICRUSt也包含有拷贝数校正的功能。

     然而,既然是基于数据库,那么,考虑到数据库中的信息数

     量,仍然是不够全面的。

     09污染问题DNA提取试剂盒、PCR试剂和实验室环境中产

     生的微生物

     DNA污染在研究低微生物量样品时可能会造成

     非常严重的影响。

     1、阴性对照(或仅仅只有试剂)可以比

     较好的发现问题。

     2、处理之前的随机抽样可能有助于减少此类问题发生。

     具体的解决污染的方法:

     1、去除PCR试剂背景污染物的扩增:

     Primer-extension

     PCR(对其他来源污染没有影响

     )

     2、去除试剂和实验室环境中的DNA污染:紫外线和γ辐射、酶处理、硅基膜过滤、CsCl2密度梯度离心法、漂白剂/CoPA溶液处理等。

     Note:想要开展靠谱的

     16S研究,建议包含

     reagent-only

     controls(例如,DNA提取试剂盒和

     PCR控制)。

     10模拟细菌群落

     1、MockCommunities:已知比例的预混合

     细菌群落是一个很好的量化误差的方法。模拟群落可以从美

     国标准菌库(ATCC)或ZymoResearch获得。2、Spike-in

     standards:在每个样本中添加标准物,以在单样本基础上进

     行质量控制。为防止与样本序列存在交叉,此处要选择不太

     可能出现在感兴趣样本中的细菌,或者

     insilico设计的和数

     据库中有差异的序列。

     Note:推荐!马上要做16S测序了,来划个重点吧:

     记录并保存好所有实验中的原始数据研究方法不同时,比较需谨慎。

     尽可能从新鲜样本中提取DNA,或在相同的时间内用同样的方法保存样本。

     采用beatbeatingDNA提取方法可让细胞裂解更充分。

     参考文献选择适合的引物(注意:通用引物往往不通用!)对完全重叠的reads去冗余,使研究结果更接近真实微生物群落。

     在测序的每一个

     run里设置模拟微生物群落。

     在每个run中做一个只有试剂的阴性对照,进一步避免潜在误差。

     除此之外,最重要的是,良好的是实验设计,以及从样品制

     备一直到后期分析的方法一致性。

     /End.

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